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免疫組化實驗中常見背景著色的8大原因
來源：菲恩生物 發(fā)布時間：2019-09-18 11:37 點擊量：
免疫組化是應用免疫學基本原理-抗原抗體反應，即抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細胞內抗原（多肽和蛋白質），對其進行定位、定性及相對定量的研究。
然而理想是豐滿的，實際操作起來卻是骨感的，作為一種分析方法，常常會存在非特異著色的背景問題。下圖中靶點均為胞膜定位，左邊背景著色嚴重，右邊染色效果優(yōu)良。
菲恩生物自主開發(fā)幾千種抗體，積累了豐富的抗體檢測經驗，經過上萬次切片檢測，從中摸索和總結出造成非特異著色的幾大主要因素。
1.抗體質量問題
抗體本身在靶點設計上如果特異性不夠，會導致非特異著色。一般來說，單抗在特異性上相比多抗是具有優(yōu)勢的，但多抗由于識別任一抗原上的多個表位，多抗可放大低表達水平靶蛋白的信號，對微小抗原變化（例如多態(tài)性、糖基化異質性或者輕微變性）的包容性更強，可用于非免疫原物種的靶蛋白的檢測實驗。具體實驗時，還應根據(jù)實際需要選擇合適的抗體。另外，抗體保存也應注意防腐及防止反復凍融。
2.內源性酶和生物素
當選用肝、腎，脾組織作為樣本時，由于這些組織本身含有較高含量的過氧化酶和生物素，對于使用Hrp或生物素-親和素顯色系統(tǒng)的實驗都會造成非特異性染色。對于內源性過氧化物酶，可以用0.9%的雙氧水來滅活。對于內源性生物素，染色前將切片浸于25 μg/mL親和素溶液中15分鐘，PBS清洗15分鐘后即可染色。也可以24 mg/mL的卵白素封片15分鐘。
3.抗體濃度過高
為了獲得良好的染色結果，一般應優(yōu)化一抗的使用濃度，可參考供應商提供的說明書，但預實驗也是必不可少的，摸索出最理想的工作濃度。
4.DAB染色時間太長/變質
DAB的作用時間過長，同樣會造成背景。DAB的顯色時間不是一成不變的，實驗時應及時鏡檢，出現(xiàn)淺棕色時，馬上沖洗。出現(xiàn)棕色的時間過短，表明抗體濃度過高；出現(xiàn)棕色的時間過長，表明抗體有效濃度過低。DAB要保存于避光干燥的地方，現(xiàn)用現(xiàn)配，臨用前才加入H2O2。
5.組織變干
另外，整個實驗過程中應保持樣本表面和外圍濕潤，避免因試劑流失導致背景的產生。顯色時，一次不要同時染過多張片子，可分批顯色。
6.浸泡時間過長
切片應避免在緩沖液或修復液里面浸泡過夜，整個實驗過程應是連貫的，減少非必要程序和未知因素干擾。
7.清洗不充分
抗體孵育后的清洗應充分，PBS使用前應確定pH值，必要時可添加Tween-20增加洗滌強度。
8.封閉問題
免疫組化一般使用血清稀釋液進行封閉，為排除二抗本身造成的非特異吸附，可使用二抗動物的非免疫血清，例如二抗是羊抗兔，就要選擇非免疫羊血清。用PBS稀釋為3-10%的溶液孵育切片，37°C 10-30分鐘，封閉后不用清洗，直接甩掉即可。另外組織固定后可能會殘留部分游離醛基，在孵育抗體過程中也可能產生非特異結合，此時可使用0.3M 甘氨酸進行封閉。
以上就是免疫組化實驗中常見的背景著色的原因，希望對大家的實驗結果改進有幫助。
然而理想是豐滿的，實際操作起來卻是骨感的，作為一種分析方法，常常會存在非特異著色的背景問題。下圖中靶點均為胞膜定位，左邊背景著色嚴重，右邊染色效果優(yōu)良。
1.抗體質量問題
抗體本身在靶點設計上如果特異性不夠，會導致非特異著色。一般來說，單抗在特異性上相比多抗是具有優(yōu)勢的，但多抗由于識別任一抗原上的多個表位，多抗可放大低表達水平靶蛋白的信號，對微小抗原變化（例如多態(tài)性、糖基化異質性或者輕微變性）的包容性更強，可用于非免疫原物種的靶蛋白的檢測實驗。具體實驗時，還應根據(jù)實際需要選擇合適的抗體。另外，抗體保存也應注意防腐及防止反復凍融。
2.內源性酶和生物素
當選用肝、腎，脾組織作為樣本時，由于這些組織本身含有較高含量的過氧化酶和生物素，對于使用Hrp或生物素-親和素顯色系統(tǒng)的實驗都會造成非特異性染色。對于內源性過氧化物酶，可以用0.9%的雙氧水來滅活。對于內源性生物素，染色前將切片浸于25 μg/mL親和素溶液中15分鐘，PBS清洗15分鐘后即可染色。也可以24 mg/mL的卵白素封片15分鐘。
3.抗體濃度過高
為了獲得良好的染色結果，一般應優(yōu)化一抗的使用濃度，可參考供應商提供的說明書，但預實驗也是必不可少的，摸索出最理想的工作濃度。
4.DAB染色時間太長/變質
DAB的作用時間過長，同樣會造成背景。DAB的顯色時間不是一成不變的，實驗時應及時鏡檢，出現(xiàn)淺棕色時，馬上沖洗。出現(xiàn)棕色的時間過短，表明抗體濃度過高；出現(xiàn)棕色的時間過長，表明抗體有效濃度過低。DAB要保存于避光干燥的地方，現(xiàn)用現(xiàn)配，臨用前才加入H2O2。
5.組織變干
另外，整個實驗過程中應保持樣本表面和外圍濕潤，避免因試劑流失導致背景的產生。顯色時，一次不要同時染過多張片子，可分批顯色。
6.浸泡時間過長
切片應避免在緩沖液或修復液里面浸泡過夜，整個實驗過程應是連貫的，減少非必要程序和未知因素干擾。
7.清洗不充分
抗體孵育后的清洗應充分，PBS使用前應確定pH值，必要時可添加Tween-20增加洗滌強度。
8.封閉問題
免疫組化一般使用血清稀釋液進行封閉，為排除二抗本身造成的非特異吸附，可使用二抗動物的非免疫血清，例如二抗是羊抗兔，就要選擇非免疫羊血清。用PBS稀釋為3-10%的溶液孵育切片，37°C 10-30分鐘，封閉后不用清洗，直接甩掉即可。另外組織固定后可能會殘留部分游離醛基，在孵育抗體過程中也可能產生非特異結合，此時可使用0.3M 甘氨酸進行封閉。
以上就是免疫組化實驗中常見的背景著色的原因，希望對大家的實驗結果改進有幫助。
