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發(fā)現(xiàn)外泌體鑒定的重要性

來源：菲恩生物   發(fā)布時間：2023-09-26 16:36   點擊量：

外泌體最早于1983年發(fā)現(xiàn)于體外培養(yǎng)的綿羊紅細胞上清液中，1996年成為免疫學(xué)家的興趣點。外泌體是目前為止定義最為明確的細胞外囊泡, 在細胞通訊和組織微環(huán)境調(diào)節(jié)中的重要作用。
 
外泌體由很多細胞釋放，如B細胞，樹突細胞，T細胞，表皮細胞，血小板等。存在于各種體液如羊水，腹水，鼻灌洗液，唾液，血清，血漿，乳汁，尿液，腦脊髓液，以及從細胞培養(yǎng)基等。細胞生成外泌體的生理目的推測是外泌體可能從細胞中清除過量和/或不必要的成分，以維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。
 
 
外泌體富含膽固醇和鞘磷脂，具有脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，幾乎所有的外泌體都有微管蛋白、肌動蛋白結(jié)合蛋白、四跨膜蛋白。不同細胞來源的外泌體組成存在差異,例如腸上皮細胞來源的外泌體含有多種代謝酶及腸組織特異性A33抗原，B細胞來源的外泌體富含CD86和MHC分子，T細胞來源的外泌體表面有促凋亡的FasL受體。以下為典型外泌體的結(jié)構(gòu)和內(nèi)容物。
 
 
外泌體與免疫反應(yīng)、病毒致病性、妊娠、心血管疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病和癌癥進展有關(guān)。外泌體遞送到受體細胞的蛋白質(zhì)、代謝產(chǎn)物和核酸有效地改變了它們的生物學(xué)反應(yīng)。這種外泌體介導(dǎo)的反應(yīng)可能是疾病促進或抑制。外泌體在調(diào)節(jié)復(fù)雜的細胞內(nèi)通路中的內(nèi)在特性推進了其在許多疾病的治療控制中的潛在效用，包括神經(jīng)退行性疾病和癌癥。
 
外泌體被提取后一般懸浮于磷酸鹽緩沖液。目前, 最常用的儲存方法為冷凍保存, 但是冷凍保存可能會導(dǎo)致外泌體形狀與物理性質(zhì)的改變, 也可能導(dǎo)致多層囊泡的形成和聚集, 反復(fù)凍融會導(dǎo)致外泌體表面分子的生物特性、含量和標(biāo)志物組成發(fā)生變化。對于功能性研究，根據(jù)研究設(shè)計建議對新鮮分離的外泌體進行立刻分析或在4 ℃或-20℃下短期保存后使用。但是對于長期保存用于治療應(yīng)用的外泌體，-80℃存儲條件將是更可取的。
 
外泌體分離之后，需要經(jīng)過一系列鑒定才能確定分離的是外泌體。鑒定方法從物理特征到表面分子標(biāo)志物，多角度進行鑒定。主要方法包括：
透射電鏡鑒定法：簡稱TEM，適合外泌體雙層囊膜超微結(jié)構(gòu)觀察，即通常為茶托型或一側(cè)凹陷的半球形。
納米顆粒跟蹤分析法：簡稱NTA，該方法能保證外泌體原始狀態(tài)、檢測速度快，檢測后能提供外泌體粒徑和濃度信息。
Western blot分子標(biāo)志物檢測：外泌體標(biāo)志蛋白包括四跨膜蛋白家族，如CD9、CD63和CD81；細胞質(zhì)蛋白，如肌動蛋白（Actin）和鈣磷脂結(jié)合蛋白（Annexins）；參與生物功能的分子，如凋亡轉(zhuǎn)接基因2互作蛋白X（ALIX）、腫瘤易感基因101蛋白（TSG101）、熱休克蛋白（HSP70、HSP90），以及細胞分泌的特異性蛋白。
親脂染料標(biāo)記外泌體：目前已發(fā)表的外泌體文章中，外泌體大多使用親脂性染料進行標(biāo)記，體內(nèi)和體外都有較多應(yīng)用。親脂性染料主要分為兩大類，第一類是PKH67（綠色熒光）/PKH26（紅色熒光），由于它們可以與外泌體的脂質(zhì)雙層膜穩(wěn)定結(jié)合，所以染色效果較好，應(yīng)用較廣泛。
 
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