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a)用包被緩沖液稀釋單克隆抗體，濃度分別為10ug/ml、5.0ug/ml、2.5ug/ml、1.0ug/ml, 包被酶標板，每一濃度包被1橫行，每孔100ul。4 ℃過夜包被，洗滌3次；

 

b)5%脫脂奶粉封閉酶標板， 37℃孵育1h，洗滌3次；

 

c) 在每條包被孔中加入空白對照和標準品，每個空白對照和標準品為一組，依次加入，各100ul，37℃孵育1h，洗滌3次；

 

d) 在每一包被濃度的一挑中分別加入按1:2000、1：4000、1：8000、1:16000 稀釋的兔多抗， 37℃孵育1h，洗滌3次；

 

e) 在每一包被濃度的一條中分別加入HRP標記羊抗兔igG，稀釋度先按說明書上的推薦稀釋比進行稀釋，37℃孵育30min，洗滌5次；

 

f) 加TMB底物，37℃避光顯色10-15min，用2mol/L H2SO4終止反應，酶標儀450nm讀取吸光度（OD）值；

 

g) 測得的標準品OD值在2.0左右，陰性對照OD值小于0.1的組合為較理想的組合。

 

可根據(jù)初步確定的濃度縮小間距,再做進一步棋盤滴定,尋找最佳包被條件。

 

注意：抗體做稀釋時最好用同一個原始濃度做倍比稀釋，這樣可以盡量減少由于加樣槍造成的誤差及人為誤差。

加樣方法參考下表：

注：1.  1,2,3,4條分別包被不同濃度單抗，如紅色框所示；2.縱列分別加入標準品和blank孔，相應加入稀釋好的多抗；3.整板加入推薦稀釋比的二抗。

由此表可以看出，選擇包被1ug/ml，多抗用1:4000，效果最佳。