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選擇合適的內參抗體注意這5大因素
來源：菲恩生物 發(fā)布時間：2023-07-28 09:50 點擊量：
一、通用內參抗體定義及應用
內參蛋白即內部參照蛋白，對于哺乳動物細胞表達來說一般是指由管家基因編碼表達的蛋白，它們在各組織和細胞中的表達相對恒定，在檢測蛋白的表達水平變化時常用它來做參照物。
所有WB實驗都需要內參，用以校正蛋白質定量、上樣過程中存在的實驗誤差，保證實驗結果的準確性。此外使用內參可以作為空白對照，檢測蛋白轉膜情況是否完全、整個Western Blot顯色或者發(fā)光體系是否正常。
二、內參抗體使用方法
1.標記內參使用法：只要在二抗孵育時加入HRP標記內參抗體，按照正常操作即可。
2.普通內參：當目的蛋白的分子量大小與選用的內參蛋白分子量相差不大時，可以先進行目的蛋白的抗體溫育顯色和檢測。然后使用Strip緩沖液洗掉膜上的抗體，重新進行內參蛋白的抗體溫育、顯色檢測。
3.當目的蛋白的分子量大小與選用的內參蛋白分子量大小相差比較明顯情況下，可以在轉膜后預染，根據(jù)蛋白質Marker的大小將膜剪為大分子量和小分子量兩部分，使內參蛋白與目的蛋白分開。然后兩塊膜分別與內參蛋白抗體以及目的蛋白抗體進行。
三、在種類繁多的內參抗體中，如何選擇合適的內參抗體至關重要
1.考慮目的蛋白分子量，一般需要與目的蛋白分子量相差5kD以上。
2.根據(jù)蛋白表達位置選擇不同的內參，不同細胞器選擇的內參也不同。參考如圖
3.考慮組織特異性。以下為各種小鼠組織中常見內參的表達水平，供大家參考。
4.考慮試驗處理條件對于內參表達的影響。
由于GAPDH是糖酵解過程中的酶，所以關于糖代謝的研究（如糖尿病模型）不能選擇GAPDH作為內參；而某些細胞中，缺氧也會影響GAPDH的表達，此時也不可以選擇GAPDH作為內參；將腫瘤組織與正常組織相比時，最好也不要選擇GAPDH作為內參，因為很多腫瘤組織中的GAPDH相對于正常組織是高表達的，并且有文獻報道GAPDH可以作為腫瘤標志物。
1) 做細胞骨架相關的研究時不能選擇β-actin作為內參；
2) 做細胞毒性實驗時，TBP和Lamin B會發(fā)生變化，此時不可以選擇其作為內參；
3) 在加入抗癌和抗真菌藥物時，Tubulin的表達易受影響，不適合作為內；
4) PCNA不適合作為非增殖細胞的內參等。
5.不同的組織特異性
actin 即肌動蛋白，有6種異構體，存在組織分布特異性。β-actin作為內參是得到了公認的，但是也有特殊情況，比如脂肪組織中 β-actin含量就很低，在肌肉組織中beta-actin分布就很少，心肌主要是alpha-cardiac muscle actin。因此不同的組織本來就應該選擇不同的內參，不能一概而論。
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